Pregabalin nije agonist GABAA ili GABAB receptora.
Pregabalin je gabapentinoid i djeluje tako što inhibira određene kalcijumove kanale.Konkretno, to je ligand pomoćnog mjesta α2δ podjedinice određenih naponsko zavisnih kalcijumskih kanala (VDCC), i na taj način djeluje kao inhibitor VDCC-a koji sadrže α2δ podjedinicu.Postoje dvije α2δ podjedinice koje se vezuju za lijek, α2δ-1 i α2δ-2, a pregabalin pokazuje sličan afinitet za (i stoga nedostatak selektivnosti između) ova dva mjesta.Pregabalin je selektivan u vezivanju za α2δ VDCC podjedinicu.Uprkos činjenici da je pregabalin analog GABA, on se ne vezuje za GABA receptore, ne pretvara se u GABA ili drugi agonist GABA receptora in vivo, i ne modulira direktno GABA transport ili metabolizam.Međutim, otkriveno je da pregabalin proizvodi dozno-zavisno povećanje moždane ekspresije L-glutaminske kiseline dekarboksilaze (GAD), enzima odgovornog za sintezu GABA, i stoga može imati neke indirektne GABAergične efekte povećanjem nivoa GABA u mozgu.Trenutno nema dokaza da su efekti pregabalina posredovani bilo kojim drugim mehanizmom osim inhibicijom VDCC-a koji sadrže α2δ.U skladu s tim, čini se da je inhibicija VDCC-a koji sadrže α2δ-1 od strane pregabalina odgovorna za njegove antikonvulzivne, analgetske i anksiolitičke efekte.
Endogene α-amino kiseline L-leucin i L-izoleucin, koje po hemijskoj strukturi veoma liče na pregabalin i druge gabapentinoide, su očigledni ligandi α2δ VDCC podjedinice sa sličnim afinitetom kao gabapentinoidi (npr. IC50 = 71 nM izoleucin), a prisutni su u ljudskoj cerebrospinalnoj tekućini u mikromolarnim koncentracijama (npr. 12,9 μM za L-leucin, 4,8 μM za L-izoleucin).Teoretizirano je da oni mogu biti endogeni ligandi podjedinice i da mogu kompetitivno antagonizirati efekte gabapentinoida.U skladu s tim, dok gabapentinoidi kao što su pregabalin i gabapentin imaju nanomolarne afinitete za α2δ podjedinicu, njihove potencije in vivo su u niskom mikromolarnom rasponu, a za ovu neusklađenost je vjerovatno odgovorna konkurencija za vezivanje endogenih L-amino kiselina.

U jednoj studiji je utvrđeno da pregabalin posjeduje 6 puta veći afinitet od gabapentina za VDCC koji sadrže α2δ podjedinicu.Međutim, druga studija je otkrila da pregabalin i gabapentin imaju slične afinitete za ljudsku rekombinantnu α2δ-1 podjedinicu (Ki = 32 nM i 40 nM, respektivno).U svakom slučaju, pregabalin je 2 do 4 puta jači od gabapentina kao analgetik, a kod životinja se čini da je 3 do 10 puta jači od gabapentina kao antikonvulziva.